本文来源“@Ayumi的癫狂”的微博，科研大匠、原题：一个漫长的工作，转载请联系原作者授权2021年1月19日在Cell Research上线了一篇文章，Direct control of store-operated calcium channels by ultrafast laser，我们实现了用激光直接特异性地控制细胞SOC钙离子通道，而不需要光遗传技术。我们给出了完整的分子机制，以及在多个细胞系和在体水平上（不开颅的活体小鼠大脑的神经元）上实现了调控。这个工作实验上做了四年多，发表拖了两年，过程极其坎坷艰辛，记录如下。这篇文章是我的学生程攀和田晓莹为核心做的。最开始是程攀刚刚本科毕设的时候，在我这里做了一些简单的预实验，主要是用飞秒激光刺激细胞，看钙信号的变化。那时我刚开始在交大建实验室，其实就是在测试系统性能，我想着本科生毕设刷一篇BOE或者APL也挺酷炫，就设计了一个套路化的思路让他去做，很快拿到了一些简单的数据。我注意到细胞的钙上升对飞秒光的波长极其敏感，当时他在700，800，和1000 nm各测了一组点，同样的钙内流需要激光的功率相差达到20倍以上。我非常惊讶，让他进一步测整个700-1000 nm的光谱。为了保证数据公平可靠，每次测量前我们都要对系统和细胞进行工程上的calibration，整个过程异常枯燥琐碎，程攀也多次抱怨，不过好在他坚持了下来。当整个光谱（就是最后的Fig. 2a）展现出来的时候，我知道事情一定很复杂，细胞对激光波长的敏感性达到了令人震惊的程度，这绝不是一个简单的多光子激发过程——它对波长不敏感，而是有某个分子参与其中。我当时想不到会是离子通道，而是猜测是细胞内的某个分子。由于光谱（其实是个残缺的谱，700 nm以下的数据至今也没有拿到）峰值在700 nm，对应的双光子吸收特征分子最可能的是NADH。我请教了学院的NADH专家殷老师，他猜测线粒体-ROS会是主因。我心中异常失望，因为这是一个非常无趣且没用的机制。我让程攀测量了线粒体的膜电位、ROS等所有指标，并使用了一大堆ROS的scavenger，结果再次出乎意料，线粒体的指标在整个钙内流过程中没有变化，mitoROS也没有变化。实验走上了死路，但也意味着新的机会。当时我在和程和平院士有一个简单的合作，我帮他们做一个飞秒激光精确调节线粒体状态的技术工具，刚好程院士来上海开会，我去找他当面讨论了我现在这个工作。程老师非常认真地听了我所有的结果和推测，但他依然说“除了NADH，不会有别的可能”。我心中再次极度失望。然而我和殷老师合作的时候，帮他测到了一个皮肤自荧光的现象，在分析数据的时候，我查了大量的分子光谱的论文，发现flavin在700-800 nm波段具有非常好的双光子吸收峰。那么会不会是flavin？为了验证这个思路，我设计了一个当时感觉非常精巧后来看来比较低效率的实验，就是在双光子激发后测量flavin的自荧光变化。这次猜对了，激光激发区域的flavin自荧光出现了显著性下降，而且激光激发钙内流的效率与细胞本身的flavin水平呈现极高的相关性。当然，我当时是思路依然绕着线粒体在打转转。于是我们立刻去费了很大劲调了细胞的flavin水平，包括用RNA调节FAD的酶，使用RF以及FAD培养细胞等。结果显示，flavin非常重要。然而，这些结果却一直和线粒体-ROS没有什么关联。我们做了一个精细的观测钙内流的实验，并且用了一大堆各种荧光蛋白去visualize钙内流在各个亚细胞结构中传播的过程，发现这个过程是从细胞膜上开始了。所以是离子通道？整个钙内流的过程是缓慢的，最疑似的莫过于SOC通道，当然还有TRP通道。程攀争辩说并不能排除细胞内的诸如RYR，细胞膜上的P2X，P2Y等。好在验证SOC是我的老本行，我们筛选了一大堆离子通道抑制剂，做了TRP和TRPC的排除，做了经典的add back实验，并用siRNA调了Orai1的水平。这些结果让我心中已经九成相信，就是SOC。于是整个实验过程中最困难的一步来了，钙内流光谱和flavin相关，钙内流过程与SOC相关，flavin和SOC是八竿子打不着的东西啊，这tmd是啥原因。我们整天都在苦苦查论文寻找灵感，我作为一名极度悲观主义者，程攀更是，我们一度自我怀疑我们的数据有问题。但我表面上装作信心很足，先不管机制，继续往前做。于是我们先做了一个Orai1的分子动态表征，观测了Orai1在激光激发的过程中（这个过程很短，最快只需要63 ms）的聚集现象，并用这个现象进一步给出了一些机制上的结果。我希望能进一步测量SOC活化的膜片钳数据，这是离子通道验证的金标准。我们四处打听哪里有搭载膜片钳的双光子系统，但一无所获。就在打算放弃了开始写论文投个BOE的时候，一个转机出现了。程攀告诉我，他刚刚听了一个报告，Leica公司邀请了中科大的鲍进老师讲双光子系统，他会后找鲍老师聊天，发现他们那儿有这个系统。我立刻联系了鲍老师，问能否到他们那里做个实验，鲍老师和我讨论了一些细节之后就答应了，我又进一步联系了他们实验室主任也是中科大生科院院长，我的校友学长薛天教授。薛老师也很nice地答应没问题。既然要过去，只做一个实验性价比不足，我又查了薛老师的工作，发现他们那里还可以看脑片，于是又设计了一个in vivo的demo实验，鲍老师说没问题。我带着程攀去了合肥，住在科大西区门口的一个破宾馆里。这是我本科毕业十年后第一次回母校，没想到是去做实验的。在过去的路上，我们依然在讨论可能的机制，到科大的时候已经是晚上，我和鲍老师约好第二天一早去实验室。我带程攀吃了我记忆中的小马烧烤，感觉味道下降了很多，但他作为一个上海读书的土包子，依然震惊于味道居然这么好。吃过饭，我们各自回房间查文献。我依然记得那天晚上，凌晨一点多，程攀问我，贺老师睡了吗？我说没有。他说那你来我房间一下，我有重大发现。我过去一看，程攀说他在看光遗传BLUF和LOV体系的时候，有一个经典机制，就是flavin可以和Cys形成硫醚键，我们是否可以参考。我当时刚刚好也在看Orai1的分子结构，我说我知道Orai1上有三个Cys。讨论到了三点多才睡。一切都存在了理论上的解释。在科大做实验非常不顺利，一方面是在别人的实验室肯定什么都是不顺手的，一方面膜片钳我们都不会，难度也非常大。鲍老师亲自上阵也没解决。我第二天还有课，就先回了上海，留下程攀继续享受实验和合肥的美食。在鲍老师和薛老师的支持下，我们最终只拿到了一点点膜片钳的数据，不完整。但我们幸运地拿到了脑片的数据，也就是说，我们这个技术是可以在在体水平上工作的。我又让程攀做了活体小鼠的结果，没想到效果也是出人意料的好。这时时间已经过去了两年多，程攀处于硕士毕业的阶段。我就先把整个数据整理完，写了一篇机制上很不完备的论文。我觉得这个工作的核心在于我们第一次发现了激光是可以直接控制SOC通道的，可以利用细胞内源性的flavin作为感光基团。我把论文发给了science的编辑和nature biotech的编辑看。他们都给了很好的评价，于是我就匆匆投了nature biotech，我的dream journal，当时我还数了一下，整个中国大陆以第一单位在nature biotech上发的论文不超过10篇。论文很快送审，那是2017年的暑假，我极度开心，但也非常忐忑，我知道整个工作非常粗糙，漏洞百出，没有完整的机制，通篇都是推测，也缺少应用上的验证。2017年10月，我在给本科生上课前收到了nature biotech的邮件，拒稿，但建议修改后重投。四个审稿人，审稿意见写了11页，只有一个人给了很高的评价，建议补一些小实验，有一个人建议大修，一个人建议把机制做完整，还有一个人没有看懂，长篇大论说这个肯定是ROS的机制。我看得非常生气，那天整个上课的时候都魂不守舍，手都在发抖。接下来我和学生们认真地把意见一条一条过，一条一条设计实验，基本上除了一个加强在体应用的建议以外，其它的意见我们感觉都可以通过实验论证。我又有点开心，先大致写了一个回应给编辑，问他我们大概这样修行不行，编辑简单地说，加油，我期待看到你们的修改。我们最核心的机制基本就是在这个阶段完成的，特别是最重要的flavin与Cys结合是否通过thioether bond，以及Orai1通过疏水键结合等等。为了应付所谓应用，我们做了一个很糙的demo，用拮抗剂抑制了脑片的神经元，然后用激光打开。这个实验其实也很糙的，但我当时沉醉于做出了一种不需要光遗传的光遗传工作的美梦中，没想太多。论文改完，已经是2018年底，投回去没多久，另外几个审稿人表示问题不大了，但之前那个负面审稿人依然没有被说服，编辑还说你们怎么没有做动物行为学的技术验证呢？再次拒稿。我非常不服，appeal了一次，还是被拒了。当时心中极其不爽，然后转投了nature methods，很快送审了。我心中再次充斥了希望。然后到了2019年过年之后，nature methods意见出来了， 也是四个审稿人，两个人给了很好的意见，都是推荐发表，其中一个给的意见非常有建设性，他建议我们分别把三个Orai1上的Cys突变掉，这样就能筛选出来flavin究竟是和哪个Cys结合的。一个人给了一些修改意见，比较简单，一个人给了四条意见，刀刀见血，分别是，没有膜片钳，没有行为学，没有与光遗传的技术比较，没有通道唯一性的证明。编辑出人意料的拒稿，我不服，appeal，再被拒。我心中已经充满了绝望。当时程攀已经在学校待到了最后一刻，即将去纽约大学医学院读博。我对审稿意见还是很佩服的，就让第二个学生田晓莹接手。为了针对审稿意见做实验，我们需要搞到Orai1-KO的细胞。我查论文的时候看到北大的陈良怡教授之前也做过很多Orai1的工作，就抱着一丝希望问他有没有，他说北师大的王友军教授那边有。我联系了王老师，拿到了至关重要的Orai1-KO和Orai1,2,3-KO的HEK293细胞。为了保险，我们也构建了相应的HeLa细胞。我们在这些细胞上做了Orai1-KO和rescue实验，以及Cys三突变实验，找到了flavin是和C195和C143结合。此外我们也做了FRET实验，直接证明了Orai1在激光激活后确实是形成了分子键结合。到了这一步，机制上已经非常完备了，唯一的短板还是应用。我抱着希望投回了nature methods，但编辑没有送审，于是我又转投nature photonics，没想到送审了，很快三个审稿人回来，两个推荐发表，一个给了一点小意见，但编辑居然拒稿了。我完全不懂为啥，编辑说这个工作太过于生物，建议你投NCB。我心情已经糟到了极处，又投了NCB，这个太难，毕竟是仅次于cell的大刊，不会理我们这种做方法的。果不其然，论文都没送审就被拒了。我觉得是不是我写得不好，于是就把论文发给了我的老朋友，东大的Goda教授。他把我批了一顿，说这个文章要是一早给他来改，绝对早就发了。我们写得太差。于是在2020年疫情最严重的那几个月，Goda给我改了一轮又一轮的论文，然后他建议我投science advances，毕竟被N系杂志拒得满头包，新系统新气象。投给sci adv我是很不爽的，它在我心中是和NC差不多的“水刊”，论文质量良莠不齐。我心中带着鄙夷投过去，很快送审，但没想到就很快又被拒。我看了审稿意见，基本没怎么读我们的文章，如果写response letter，基本就是给审稿人做科普和反驳。我心中极其不满，写信给编辑把审稿人骂了一顿，我俩在email里来回吵架。至此我已经感到心力交瘁，Goda教授让我赶紧投PNAS。我因为还想着用这篇文章来争取项目，想搞个快的，于是不听他的，把整个nature biotech， nature methods，和nature phtonics的审稿意见以及response letter发给了cell research的编辑李党生教授，问他有没有可能快速送审快速决定。我记得他以前和我说过，可以这样操作。李博士非常认真地读完所有材料和我们的论文，我知道这个是因为他回信的时候还和我罗列了一堆论文里的一些小错误，和我写的response letter里不对的地方（这一点让我在最黑暗的时刻感到很温暖），和我说可以给我快速送审。于是很快论文送审，四个审稿人，三个建议接收，一个提了一些简单的意见，主要还是关于Orai1上的蛋白，不一定是C，也可能是L。于是我们又补了这么一个实验，论文终于被接收。Goda还和我说，这个杂志不好，是你们中国人的自high，还是PNAS好。我说PNAS不过是美国佬的自high，我看好国产期刊。这篇论文接收后很幸运，我收到了优青的答辩通知，也用上了这篇文章，算是得到了利益最大化。尤其幸运的是，国家真的出台了一大堆政策，来鼓励发国产期刊。我以此聊以自慰，发CR总比发NC强。这是一个功利的结局，但并不违背我的初心。整个工作过程历时四年多，投搞折腾了一两年。这对我的锻炼非常大。之前投NP的时候似乎过于顺利，我并没有得到很多成长。最近在写论文和设计思路的时候，确实明显感受到游刃有余。希望后面的这几篇文章能顺利一些，也希望我们的国产期刊能摆脱中国人自high的阴影，早日成长起来。文章链接：
https://www.nature.com/articles/s41422-020-00463-9
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